毕业论文查重

气体信号分子硫化氢对番茄生长发育的影响

西红柿是中国普遍种植的一种蔬果,由于最早产于中美洲和南美洲而取名得“番茄”,属于茄科双子叶植物,是一种多年生草本植物,由于其色彩鲜艳、口感美味、能够补充人体所需元素,且扦插繁殖比较容易存活,所以种植面积逐渐增大。番茄的成长过程大致包括了4个不同区间,即发芽期、幼苗期、开花期和结果期。发芽期是从番茄种子摆种于皿中到长出第一片真叶;幼苗期是指第一时期结束到第一个花蕾出现;开花期是花序出现到第一花序果实不会脱落的一段时间;结果期是第一花序结果到成熟采摘。此外,番茄是一种喜温喜光、生长时需要较多水分的蔬菜作物,自花授粉,其花为两性花,呈黄色,果实为浆果,红色或橘黄色的近球状果实。
长久以来,人们普遍认为H2S是工业生产中产生的有毒气体[1]。人们在上世纪90年代中期发现,哺乳动物体内可以以半胱氨酸为底物合成H2S气体,由半胱氨酸脱巯基酶催化产生,现在其生理作用及其重要性也逐渐得到科研人员的重视。
1998年,首先发现NO是心血管系统内皮舒张相关的一种信号分子,这一成果是得人们对NO这方面的气体信号分子开始研究。H2S作为一种有毒气体进入人们的视线,但是可以负责任的说,它的研究早已进行了近300年。经过科学家的不懈努力,H2S最终成为NO和CO之后新的气体信号分子[1]。三种气体分子中,NO是最早被研究的,其当时作为“明星分子”一种生物药物流行性甚广。之后发现的便是CO这一气体分子,它是一种内源性神经递质,可以与NO协同起效,参与种子萌发、根系发生、植物抵抗外界不利环境[5-6]。而H2S是三种气体分子中最晚被证实的,它同NO、CO一样,作为激活某种下游反应的分子在低浓度时促进调控动植物的发育过程。
在植物体内,H2S参与植物生长发育的多种过程,对于种子萌发、根形态建成、叶绿素含量增加、花期等生长生理过程具有一定的影响作用 [6]。H2S 作为一种气体分子还可以调节植物的光合作用,尤其是对碳固定这一阶段影响甚大。另外,对铁元素的一系列转化、利用过程也存在一定影响。经研究表明,H2S与植物激素以及其他气体信号分子可以协同发挥作用,调控生物的多种生理活动。例如,①H2S可以与脱落酸(ABA)相互作用共同调节植物气孔运动, 以增强植物应对环境胁迫的能力; ②H2S在植物根的形态和发育模式的决定中发挥重要作用;③H2S和赤霉素(GA)协同发挥作用可以解除种子休眠[7]。在动物的研究中发现H2S可以对许多脏器起保护作用,对血管平滑肌细胞起消除作用,对多种疾病的治疗起积极的调节功能[8-10]。H2S在动植物生理作用领域可以发挥多重作用,这样存在的重要意义已经得到了许多研究人士的密切注意。
H2S之所以能够作为一种气体信号分子,是由于其具有气体信号分子的特点,即①是一种小分子质量的气体分子,可以自由渗入细胞膜发挥生物效应;②作用不依赖于相应的质膜受体;③特定酶催化特定底物合成的内源气体,按照代谢信号途径调控气体产生;④在生理浓度下发挥特定的生理功能;⑤第二信使存在不影响其发挥作用,靶点相反却具有特异性[7]。随着对H2S研究的不断深入,人们对H2S 的认识也在不断变化,从过去的集中于毒理方面的研究到目前将其作为一种气体信号分子来研究,H2S 经历了相当长的一段时间。H2S可以产生的影响举例如下,①硼,其在体内过量积累会产生“发育必需微量元素”的相反毒性,表现为根长的相对减少。有研究表明用H2S供体NaHS处理黄瓜幼苗能够缓解由于硼毒所引起的幼苗根伸长抑制[11]。②镉,镉不仅对植物、在动物体内积累也会产生不良反应。H2S供体NaHS可以减少镉在苜蓿幼苗中含量积累,并且减少由于镉毒引起的质膜过氧化损伤[12]。③缓解铬、铜、铝毒害[13-15]。④降低干旱渗透胁迫[16-18]。⑤促进根的生长发育[19-20]。⑥增强对热激的耐性[21]。⑦提高植物对盐害的抗性[22]。⑧延长植物花期和果实保鲜[23-24]。⑨延缓植物衰老[25-26]。
羟胺(Hydroxylamine, HA)熔点为32.05℃,沸点为70℃,易吸潮且易溶于水,微溶于乙醚、苯等有机溶剂。羟胺能够去除内源性H2S,不能使其正常发挥作用,所以本实验数据预在去除羟胺情况下测量。通过H2S处理下番茄不同的形态变化,研究气体信号分子在番茄生长发育过程中可能起到的作用以及对调节机制的理解,并且确定H2S适宜的处理浓度,为以后的研究提供参考。
2.材料与方法
2.1材料准备
2.1.1 实验植物
以野生型MicroTom、Ailsa Craig、3021和中蔬四号(ZS4)番茄种子为材料。
2.1.2主要试剂
硫氢化钠、无水乙醇、次氯酸钠。
2.1.3 主要仪器
微量移液器:TY-2713(北京伯乐);恒温摇床:COS-211C(江苏太仓);电子天平:JA1003(上海良平);冰箱:BCD-211H(北京海信)。立式压力蒸汽灭菌器:YXQ-LS-50S11(上海博讯);洁净工作台SW-CT-1FD(上海博讯);培养皿;滤纸。
2.2实验方法
2.2.1 植物材料的培养条件    
选择均匀饱满的不同的野生型种子(MicroTom、Ailsa Craig、3021和ZS4),经过处理后的种子在培养皿中浸湿的2层滤纸上进行黑暗培养;将皿上生长7-10天的,未经H2S处理过的,已经长出两片子叶的番茄幼苗移入黑土:蛭石(1:1 V:V)的混合基质中光照生长3-5天之后进行之后的H2S熏蒸实验。所有番茄材料在相同的培养条件下生长。
处理番茄种子的方法步骤如下:
(1)将野生型番茄种子置于10mL EP管中,用95%乙醇处理2min;
(2)倒掉管中乙醇溶液,加20% NaClO溶液,水平置于摇床中处理20min;
(3)倒掉管中NaClO溶液,清水冲洗5遍;
(4)将消毒后的番茄种子摆种在垫有2层,用蒸馏水浸湿的滤纸的培养皿中,皿培番茄每皿各摆种30粒种子。
2.2.2 硫化氢的处理方法
(1)配制1 mM的NaHS溶液(母液),分别在培养皿中放置EP管盖,在盖中加入不同体积的母液,使得用不同浓度的H2S来处理番茄种子,连续处理8天,每天在同一时间处理;
(2)利用NaHS的物质的量守恒(即n=m/M=c*V),使得7 L的玻璃罩内H2S的处理浓度为50 μM,处理组分为每天熏蒸3小时(3h/d),每两天熏蒸6小时(6h/2d)两组,分别设置对照组,对照组的番茄幼苗在H2S熏蒸时也罩在相同的玻璃罩中。
2.2.3 种子发芽率、发芽势和发芽指数的检测
每天在同一时间统计每皿的番茄萌发的种子数(当下胚轴长度≥2 mm时记为萌发),在第4天统计发芽势(%),在第7天统计发芽率(%),当统计8天萌发的种子数后,计算发芽指数,每次实验需经过3次以上重复。
2.2.4 根长的测定
分别将野生型番茄种子摆种在浸湿的2层滤纸上,用不同浓度H2S处理7天,之后任取10株幼苗取出后测量其根长。
2.2.5 土培番茄植株的生长发育统计
将生长情况一致的番茄幼苗移入按黑土、蛭石等量混合的土中,在长出第一片新叶时,开始用50 μM浓度的H2S处理番茄幼苗,各实验组分别在30天、45天、60天和70天时统计数据(植株高度、真叶数、花苞数等)。 
3.结果分析
图1显示的是在不同H2S浓度熏蒸8天之后的MicroTom野生型番茄种子萌发后下胚轴的长度比较;以及将生长状况相同的番茄幼苗(MicroTom)移入土培后,幼苗经50 μM的H2S熏蒸的方法展示。如图2所示,野生型番茄(MicroTom)在有羟胺存(HA)在条件下,经过24h、48h后的发芽率为0,在72h后逐渐开始发芽,192h后发芽率发到83.3%;在去除羟胺情况下,经过24h后番茄种子已经开始发芽,24h时发芽率为3.3%,48h时发芽率为13.3%,由图可知发芽率在不断上升。用浓度为10μM的H2S处理后的番茄种子的发芽率为63.3%,浓度为50μM的H2S处理后的番茄种子的发芽率为73.3%,浓度为100μM的H2S处理后的番茄种子的发芽率为66.7%,浓度为500μM的H2S处理后的番茄种子的发芽率为40%,浓度为1mM的H2S处理后的番茄种子的发芽率为6.7%。综上所述,随着H2S浓度的升高,低浓度气体可以促进下胚轴伸长,番茄可以很好的生长,高浓度气体则产生明显的抑制作用。另外,猜测羟胺对于外源性H2S的影响作用不大,而且其只是内源性H2S的清除剂。图3为四种野生型番茄的发芽率、发芽指数、发芽势和下胚轴长度对比。由图三可知,当H2S处理浓度为10μM时,MicroTom、3021、ZS4、Ailsa Craig四种野生型的发芽指数分别为6.13、8.57、6.46、6.45,发芽率为63.3%、80%、96.7%、100%;当H2S处理浓度为50μM时,MicroTom、3021、ZS4、Ailsa Craig四种野生型番茄种子的发芽指数分别为7.77、5.82、7.88、6.47,发芽率为73.3%、66.7%、93.3%、100%;当H2S处理浓度为100μM时,发芽指数依次为6.38、8.34、7.74、5.46,发芽率为73.3%、93.3%、100%、93.3%,当H2S处理浓度为500μM时,发芽指数依次为3.17、2.99、7.25、0,发芽率为46.7%、56.7%、96.7%、0%。如图所示,当H2S浓度≥100μM,对于MicroTom、ZS4、Ailsa Craig三种野生型番茄种子来说,它们的生长发育受到抑制,而野生型番茄种子3021却能很好地生长,推测高浓度H2S下,3021抗H2S能力较好。此外,四种野生型番茄种子的发芽势在H2S处理浓度为50μM左右时最好,其下胚轴在H2S处理浓度为10μM左右时最好。综上所述,在不同的野生型番茄中普遍存在上述相关影响,其最适H2S的生理浓度为50μM~100μM,且当浓度≥10mM时,番茄幼苗死亡,但不同野生型也会有不同的表现。如图4所示,土培番茄在30d、45d、60d、70d时生长各有不同,随着时间的推移,株高越来越高,最高可达到7.88cm,但是经过H2S处理后的土培番茄的株高有所下降,株高下降到5.6cm,据此推测土培番茄生长可能受到H2S抑制。而随着时间的增长,土培番茄的花苞数却逐渐降低,但是经过H2S处理后,时间越长,花苞数反而越多,最多可达到11个。由此推测,H2S也许可以延缓植株衰老。
   4.讨论
生物体内有多种途径形成H2S,包括硫酸盐的吸收和硫化物的形成[27-29],而形成的H2S会对动植物的生长发育产生多种多样的影响,这些影响会表现在表型方面被我们所认知。本次实验中对MicroTom、3021、ZS4、Ailsa Craig四种不同野生型番茄进行了培养。将MicroTom、3021、ZS4、Ailsa Craig分别在含有浓度为0μM、10μM、50μM、100μM、500μM、1mM 的H2S中进行培养,所得到的植株在发芽率、发芽势、发芽指数和下胚轴生长等方面都有所不同。接下来对4种番茄野生型的4个方面进行比较,结果显示低浓度H2S促进番茄种子生长发育,高浓度H2S抑制番茄下胚轴生长甚至导致植株的死亡。此外,对比4种野生型的发芽指数,高浓度H2S下,H2S作为某种外界胁迫而存在,3021>MicroTom,说明3021抗H2S能力较好。
本实验是在避光黑暗条件下进行的,但在王鸿蕉等[5]研究中发现某些相关基因编码蛋白的表达量增加,白菜幼苗的光合作用强度提升,并且促进白菜幼苗的生长发育,这是因为相关的编码蛋白在电子传递等光途径中可以起到积极的功效[30-33]。此外,在光合作用的一些特性指标中,植物气孔的开启和关闭与温度也有一定关系,并且会影响光合作用。光照程度相同情况下,低温导致气孔关闭,蒸腾速率会变低,相应光合作用也会降低。在光照条件下研究H2S处理过后的番茄幼苗是我们现在所追寻的目标,有待于进一步探究。
最后,由于本实验是一次创新性实验,且实验室条件有限,在羟胺下测定野生型番茄幼苗的结果不是很准确,在此方面还有待于进一步提高,还会进行更多平行试验,对此数据进行进一步验证。
5.结语
对于番茄不同野生型之间的横向分析对了解众多野生型番茄特征方面有重要的意义,并且可以通过番茄野生型之间的比较,逐步探索其他物种相似野生型之间的研究提供相应的借鉴。帮助人类更加深刻的了解物种及自然发展的规律。

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